銅綠假單胞菌是一種革蘭氏陰性機(jī)會(huì)性病原體，常在免疫受損個(gè)體中引發(fā)嚴(yán)重感染，如醫(yī)院獲得性肺炎和泌尿道感染等。其廣泛存在于自然和人工環(huán)境中，可通過(guò)空氣、水和土壤傳播，對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成威脅。因此，快速、靈敏地檢測(cè)銅綠假單胞菌對(duì)于相關(guān)疾病的早期診斷和治療至關(guān)重要。傳統(tǒng)檢測(cè)方法如平板計(jì)數(shù)法耗時(shí)且缺乏特異性，而PCR和質(zhì)譜分析等替代技術(shù)則需要昂貴設(shè)備和專(zhuān)業(yè)人員。電化學(xué)生物傳感器因其高靈敏度、操作簡(jiǎn)便、快速響應(yīng)和低成本等優(yōu)勢(shì)，在病原體檢測(cè)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。其中，凝集素因其獨(dú)特的糖結(jié)合特異性而成為極具潛力的識(shí)別元件。LecB是一種由銅綠假單胞菌分泌的可溶性凝集素，能夠特異性結(jié)合果糖、甘露糖及其含甘露糖的寡糖。研究表明，LecB與銅綠假單胞菌細(xì)胞表面的Psl多糖相互作用，促進(jìn)生物膜的穩(wěn)定性。基于此背景，山東大學(xué)王霞課題組利用重組LecB的高特異性結(jié)合能力，并結(jié)合納米多孔金（NPG）作為固定載體，構(gòu)建了一種新型阻抗電化學(xué)生物傳感器。
該傳感器的工作原理可以概括為：銅綠假單胞菌細(xì)胞表面的Psl多糖中的α-D-甘露糖殘基與LecB蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。將LecB固定在NPG上，并進(jìn)一步修飾到GCE電極上。當(dāng)樣本中存在銅綠假單胞菌時(shí)，會(huì)與LecB/NPG/GCE結(jié)合形成一層非導(dǎo)電復(fù)合物，阻礙電子的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致電極表面的電荷轉(zhuǎn)移阻抗（Rct）顯著增加（圖1）。這種阻抗的變化可以通過(guò)電化學(xué)阻抗譜（EIS）進(jìn)行檢測(cè)（圖2）。檢測(cè)結(jié)果顯示（圖3），其電荷轉(zhuǎn)移阻抗（Rct）隨細(xì)菌濃度的對(duì)數(shù)線性增加，檢測(cè)范圍為10 CFU/mL至106 CFU/mL，檢測(cè)限低至10 CFU/mL，且相關(guān)系數(shù)（R2）達(dá)到0.994，表現(xiàn)出優(yōu)異的定量檢測(cè)能力。在特異性測(cè)試中，非目標(biāo)細(xì)菌對(duì)檢測(cè)信號(hào)的影響較小，相對(duì)變化在5.95%以?xún)?nèi)，證明了其對(duì)銅綠假單胞菌的特異性識(shí)別能力。重復(fù)性測(cè)試中，五次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于6%，表明生物傳感器具有良好的重復(fù)性，能夠在多次檢測(cè)中提供一致的結(jié)果。在實(shí)際應(yīng)用驗(yàn)證中，研究人員在自來(lái)水、牛奶和人血清等復(fù)雜樣本中進(jìn)行了加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，回收率為93.05%至119.63%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于7.85%，進(jìn)一步證明了其在復(fù)雜環(huán)境下的適應(yīng)性和可靠性（表1）。
總體而言，本研究開(kāi)發(fā)的基于重組LecB蛋白和納米多孔金的阻抗生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)銅綠假單胞菌的快速、靈敏檢測(cè)。該傳感器具有高特異性、寬檢測(cè)范圍和低檢測(cè)限，適用于多種復(fù)雜樣品。其優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)靈敏、速度快、成本效益高且易于制備，顯示出良好的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用前景。但在處理極高濃度樣本時(shí)仍存在一定的非特異性吸附效應(yīng)，且長(zhǎng)期穩(wěn)定性和規(guī)模化應(yīng)用的可行性仍需進(jìn)一步研究。
圖1 LecB/NPG/GCE生物傳感器的構(gòu)建過(guò)程及銅綠假單胞菌檢測(cè)原理。
圖2 LecB/NPG/GCE生物傳感器的制備和電化學(xué)性能表征。（A）NPG的SEM圖像，展示了其三維多孔結(jié)構(gòu)，為生物分子的固定提供了豐富的結(jié)合位點(diǎn)。（B）LecB/NPG復(fù)合材料的SEM圖像，顯示LecB蛋白成功固定在NPG表面，多孔結(jié)構(gòu)變得不明顯。（C）NPG的EDS分析，檢測(cè)到主要含有金（Au）元素，表明NPG的純度較高。（D）LecB/NPG復(fù)合材料的EDS分析，檢測(cè)到碳（C）、氮（N）和氧（O）元素，進(jìn)一步驗(yàn)證LecB蛋白成功固定在NPG表面。（E）CV測(cè)試結(jié)果，顯示NPG/GCE電極的氧化還原峰電流密度顯著高于裸GCE，而LecB/NPG/GCE電極的氧化還原峰電流密度顯著降低，表明LecB蛋白成功固定并影響了電極的電化學(xué)性能。（F）EIS測(cè)試結(jié)果，顯示LecB/NPG/GCE電極的電荷轉(zhuǎn)移阻抗（Rct）顯著增加，表明LecB蛋白的固定形成了絕緣層，阻礙了電子轉(zhuǎn)移。
圖3 LecB/NPG/GCE生物傳感器對(duì)銅綠假單胞菌的檢測(cè)性能。（A）LecB/NPG/GCE生物傳感器對(duì)銅綠假單胞菌的檢測(cè)可行性。Rct顯著增加，表明生物傳感器能夠特異性識(shí)別銅綠假單胞菌。（B）NPG/GCE電極對(duì)銅綠假單胞菌的非特異性吸附。低濃度下阻抗變化不明顯，高濃度下阻抗變化顯著，表明非特異性吸附在高濃度下有一定影響。（C）LecB/NPG/GCE生物傳感器對(duì)不同濃度銅綠假單胞菌的檢測(cè)。Rct隨濃度對(duì)數(shù)線性增加，檢測(cè)范圍為10 CFU/mL至106 CFU/mL，檢測(cè)限低至10 CFU/mL。（D）Rct與銅綠假單胞菌濃度對(duì)數(shù)之間的線性關(guān)系。（E）LecB/NPG/GCE生物傳感器的特異性。非目標(biāo)細(xì)菌對(duì)檢測(cè)信號(hào)的影響較小，相對(duì)變化在5.95%以?xún)?nèi)，表明生物傳感器具有良好的特異性。（F）LecB/NPG/GCE生物傳感器的重復(fù)性。五次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的RSD小于6%，表明生物傳感器具有良好的重復(fù)性。
表1 不同樣品中銅綠假單胞菌的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117788
來(lái)源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~鄒晶晶。
