近日，山西省市場監督管理局發布了DB 14/T 3467—2025 《制藥企業質量控制 藥品微生物檢驗無菌操作技術要求》，該文件規定了藥品微生物檢驗無菌操作在環境、儀器設備、人員、實驗操作等方面的技術要求，適用于制藥企業藥品微生物檢驗。如下：
制藥企業質量控制 藥品微生物檢驗無菌操作技術要求
1 范圍
本文件規定了藥品微生物檢驗無菌操作在環境、儀器設備、人員、實驗操作等方面的技術要求。
本文件適用于制藥企業藥品微生物檢驗。
2 規范性引用文件
下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
中華人民共和國藥典
藥品生產質量管理規范
3 術語和定義
下列術語和定義適用于本文件。
3.1 微生物檢驗
通過微生物的分離培養、生理生化反應、顯微鏡檢查等方法對樣品中的微生物進行檢驗。檢驗方法主要分為兩種：定性試驗和定量試驗。定性試驗是測定樣品中是否存在活的微生物；定量試驗是測定樣品中存在活的微生物數量。
3.2 無菌操作
在操作過程中人為地排除一切不需要的微生物，是微生物學的基本技術。
4 基本要求
4.1 微生物檢驗應在符合《中華人民共和國藥典》要求的環境中進行。微生物實驗室的布局應充分考慮實驗設備安裝、良好微生物實驗室操作規范和實驗室安全的要求。
4.2 微生物實驗室應包括潔凈區和生物安全控制區，生物安全控制區應配備滿足要求的生物安全柜。潔凈區按照《中華人民共和國藥典》要求進行日常監測和定期監測。潔凈區的空氣過濾系統應定期維護和更換，紫外線燈應根據紫外線強度檢測結果或其使用壽命參數及時更換燈管，做好相關記錄。
4.3 微生物實驗室應制定相應的標準操作規程，包括潔凈區管理，儀器設備管理、培養基管理、菌種管理、消毒滅菌程序、實驗操作等，潔凈區出入程序、潔凈區自凈時間、消毒滅菌程序、培養基貯藏條件等關鍵環節均應進行驗證。
4.4 微生物實驗室配置的儀器設備應能滿足微生物檢驗工作的需要。關鍵儀器設備應定期進行檢定校準；高壓蒸汽滅菌器按國家有關規定管理并定期檢驗，陽性高壓蒸汽滅菌器應獨立配備；儀器設備脫離實驗室或檢修后，恢復使用前應重新確認其性能符合要求。
4.5 關鍵儀器設備的使用和日常監控應有記錄，包含但不限于以下內容：
- 應對培養箱、冰箱、超低溫冰箱、高壓蒸汽滅菌器的關鍵參數(如溫度、壓力）進行連續觀測；
- 應定期對超凈工作臺、生物安全柜進行監測；
- 無菌檢查用隔離系統（以下統稱隔離系統）在操作周期內應對設備運行狀態和內部環境指標進行監測，確認其無菌維持能力；
- 每次無菌檢查開始前及結束后，宜對隔離系統的艙體和手套/袖套的完整性進行檢測，檢測頻率也可根據風險評估確定。
4.6 應定期對儀器設備進行維護和性能驗證，并記錄。容易污染微生物的儀器設備應定期清潔和消毒；超凈工作臺單次使用最高時長應經過驗證；滅菌設備應定期使用生物指示劑檢查滅菌效果，指示劑放在不易達到滅菌的部位。
4.7 從事微生物檢驗工作的人員（以下統稱檢驗人員）應具備微生物學或相近專業知識的教育背景。檢驗人員應經過相關培訓，培訓內容包括實驗技術、儀器操作、質量管理、生物安全和衛生等。
4.8 非簡單壓力容器操作人員應持有特種設備作業人員證書。
4.9 應對檢驗人員進行健康管理，并建立健康檔案。檢驗人員上崗前應進行健康檢查且以后每年至少進行一次健康檢查。
4.10 微生物實驗室僅限經批準的人員進入。任何進入潔凈區的人員均應按照規定更衣，無菌衣的選材、式樣及穿戴方式應符合《藥品生產質量管理規范》的要求。進入潔凈區時不應化妝和佩帶飾物。
5 實驗準備
5.1 開啟潔凈區空氣凈化系統、超凈工作臺風機和紫外線燈，進行自凈，使環境達到相應潔凈度。
5.2 采用經驗證的滅菌程序對實驗物品正確實施滅菌，且有明顯滅菌標識。
5.3 如需無菌取樣，應采用無菌操作技術在具有無菌條件的特定區域中進行。取樣的任何消毒過程不應影響樣品中微生物的檢出。
5.4 如使用隔離系統，將樣品和實驗物品等預清潔后放入艙體內，開啟滅菌程序。
6 實驗過程
6.1 人和物應按照經過驗證的程序進入潔凈區，控制進入人數并盡量減少人員走動。
6.2 雙手消毒后戴一次性無菌手套，在超凈工作臺中央無菌區域內進行操作。實驗操作應注意以下要求：
- 保持工作臺面整潔，必要物品可暫時放置，其他實驗物品用完后及時移出，以利氣體流通；
- 在酒精燈火焰旁的無菌區操作，動作輕緩，幅度宜小，避免不必要的動作；
- 用適宜方法對直接接觸樣品的包裝表面進行消毒后打開包裝；
- 加稀釋液時，不應觸碰樣品瓶（袋）口；
- 進行 10 倍遞增稀釋時，刻度吸管移至下一級稀釋管的內壁近液面處（勿接觸液面），緩慢放出樣液，更換新的刻度吸管進行吹打混勻（不應過于劇烈），也可置混勻器上混勻；
- 一支吸管只能吸取一種溶液，不應交叉使用；
- 加液時如吸管接觸瓶口、瓶外壁，應立即棄用，更換另一支無菌吸管繼續實驗；
- 稀釋液和培養基溫度不應超過 45℃；固體培養基滅菌后只可再融化 1 次，融化后在 45℃～50℃保溫時間不應超過 8 小時；
- 傾倒培養基時瓶口不應接觸平皿，每皿（直徑 90mm）注入的培養基量以 15mL～20mL 為宜；
- 不應在打開容器的正上方操作；
- 開啟任何一次性無菌耗材都應在超凈工作臺內完成，避免與任何物品觸碰。
6.3 每次實驗均應設置陰性對照。陽性菌操作應在生物安全控制區完成，不應與待檢樣品共用操作空間；染菌的吸管、玻片等器材應及時置于盛有消毒劑的消毒桶內消毒，待實驗結束后進行高壓蒸汽滅菌（121℃，30min）處理。
6.4 實驗過程中應同時進行沉降菌在線監測。無菌檢查結束后至實施消毒措施前，應對檢驗人員的雙手 5 指手套、實驗臺面等關鍵控制點進行表面微生物測試。
6.5 實驗結束，將實驗物品帶出潔凈區，對工作臺面和地面進行消毒，自凈后關閉空氣凈化系統。
6.6 應排除任何可能導致微生物污染的活動。出現微生物生長的培養物不應在潔凈區內打開，對染菌的樣品及培養物應有效隔離。一些樣品若需要證明微生物的生長或進一步分析培養物特性，應在生物安全控制區域進行。病原微生物的分離鑒定工作應在相應級別的生物安全實驗室進行。
7 實驗記錄
7.1 實驗記錄應至少包括以下內容：
- 實驗日期；
- 樣品名稱；
- 依據的質量標準或標準操作規程；
- 實驗參數（如環境條件、關鍵儀器設備信息、培養基名稱和批號、菌種信息、培養溫度等）；
- 實驗過程；
- 實驗結果；
- 實驗人員和復核人員的簽名等。
7.2 實驗記錄的修改應能追溯至前一版本，保存原始及修改后的數據和文檔，包括修改日期、修改內容和修改人員。
