金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）菌種是食物中毒的主要來(lái)源，并且能夠?qū)θ梭w引發(fā)各種自限性和致死性疾病。防止病原體污染是確保食品安全行動(dòng)的關(guān)鍵。廣泛采用的菌落培養(yǎng)和計(jì)數(shù)技術(shù)是評(píng)估不同樣本類型中活細(xì)菌數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)。然而，傳統(tǒng)的平板菌落計(jì)數(shù)，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），核酸為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)，以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)都存在局限性，往往需要大量的時(shí)間和精力，伴隨著高昂的成本和對(duì)精密儀器的高度依賴。因此，迫切需要快速、可靠和精確的方法來(lái)準(zhǔn)確篩選和區(qū)分致病性食物來(lái)源細(xì)菌。為了滿足這一需求，研究人員正在探索和開發(fā)新的技術(shù)方法。這些方法通常包括先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)，如實(shí)時(shí)定量PCR、數(shù)字PCR、基于測(cè)序的微生物組分析和生物信息學(xué)分析等。這些技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)和鑒定病原體，同時(shí)減少對(duì)昂貴儀器的依賴和降低操作成本。此外，生物傳感器和微流控芯片等設(shè)備也正在被開發(fā)，以實(shí)現(xiàn)更快速、成本效益高的病原體檢測(cè)。這些新技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用將極大地促進(jìn)食品安全監(jiān)控，減少食物中毒事件，保障公眾健康。

等溫核酸擴(kuò)增方法的出現(xiàn)有效地規(guī)避了傳統(tǒng)PCR方法所面臨的限制，這些限制包括需要大型且昂貴的熱循環(huán)儀，從而限制了其在資源有限環(huán)境下的可行實(shí)施。各種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)已被用于實(shí)時(shí)食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)測(cè)試。Chao Shi及其合作研究者提出了一種稱為鏈交換擴(kuò)增（strand exchange amplification, SEA）的創(chuàng)新方法，用于等溫檢測(cè)雙鏈DNA。SEA需要使用簡(jiǎn)單的引物對(duì)，通過(guò)連續(xù)的鏈動(dòng)態(tài)來(lái)分離雙鏈DNA（dsDNA），而無(wú)需熱變性。此方法因其成本效益、高效擴(kuò)增短片段的能力以及能夠由技能較低的分析人員可靠實(shí)施而區(qū)別于其他核酸擴(kuò)增技術(shù)。因此，開發(fā)基于SEA的替代方法是核酸檢測(cè)方法中的一個(gè)里程碑，作為PCR的替代品，有望實(shí)現(xiàn)快速便捷地識(shí)別食源性病原體的目標(biāo)。

表面增強(qiáng)拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering, SERS）已成為一種多功能的先進(jìn)技術(shù)，其顯著進(jìn)展包括：利用低激發(fā)功率獲取高質(zhì)量的振動(dòng)指紋信號(hào)、最小化樣品損傷以及僅需極低樣品體積。基于SERS的葡萄球菌傳感器已在文獻(xiàn)中有所記載。本研究將首次嘗試將SERS與SEA結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)葡萄球菌的快速、經(jīng)濟(jì)且特異性的選擇。然而，這種整合的成功實(shí)施依賴于兩個(gè)關(guān)鍵方面：SERS基底的選擇和輸出信號(hào)的數(shù)字化表達(dá)。首先，SERS的性能顯著受到貴金屬納米結(jié)構(gòu)的大小和形狀的影響。為了提高SERS基底上熱點(diǎn)密度和強(qiáng)度的增強(qiáng)，已投入大量努力，尤其是在具有尖銳角或納米間隙的基底上。在這方面，金屬納米花由于其顯著的曲率和電磁場(chǎng)增強(qiáng)的貢獻(xiàn)，相較于球形納米顆粒，表現(xiàn)出顯著的電磁場(chǎng)強(qiáng)化特性。此外，固相SERS基底提供了優(yōu)越的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，更適合實(shí)時(shí)檢測(cè)場(chǎng)景。對(duì)于后者，SERS-SEA的定量分析機(jī)制依賴于指紋信號(hào)特征峰的強(qiáng)度與葡萄球菌濃度的相關(guān)性。然而，由于潛在的不期望或干擾變量，在從食品樣品采集光譜時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)挑戰(zhàn)。通過(guò)集成機(jī)器學(xué)習(xí)工具來(lái)提高傳感效率，以最小化干擾變量并實(shí)現(xiàn)卓越的預(yù)測(cè)性能。

因此，本文建立了一種新穎的波長(zhǎng)選擇型機(jī)器學(xué)習(xí)驅(qū)動(dòng)的雙金屬納米花基放大表面增強(qiáng)拉曼散射系統(tǒng)，用于食品樣品中金黃色葡萄球菌的快速和便攜式檢測(cè)。所提出的平臺(tái)的示意圖工作流程如圖1所示：i）使用SEA作為特異性提取工具，對(duì)金黃色葡萄球菌的nuc靶基因（nuc T′）進(jìn)行放大；ii）合成了一種陽(yáng)極氧化鋁（AAO）過(guò)濾膜支撐的金和銀雙金屬納米花（Au/Ag FL@AAO）SERS納米基底，以在傳感系統(tǒng)中提供穩(wěn)定的增強(qiáng)信號(hào)輸出；iii）將4-ATP浸涂在Au/Ag FL@AAO納米基底表面，以通過(guò)SEA主動(dòng)捕獲由SEA弱酸水解放大的nuc T′；iv）使用偏最小二乘（PLS）、區(qū)間組合群分析-偏最小二乘（ICPA-PLS）和自助軟截?cái)啵˙OSS-PLS）的機(jī)器學(xué)習(xí)工具建立高性能預(yù)測(cè)模型，去除非特異性結(jié)合的目標(biāo)背景信號(hào)，并最終v）將所提生物傳感器應(yīng)用于食品樣本中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)和驗(yàn)證。據(jù)我們所知，本文首次嘗試將Au/Ag FL@AAO-4-ATP基SERS納米基底、SEA和波長(zhǎng)選擇型機(jī)器學(xué)習(xí)工具整合用于金黃色葡萄球菌的分析，并可能作為一種快速且成本效益高的策略，用于特定識(shí)別和量化真實(shí)樣本中的病原菌。

首先，對(duì)Au/Ag FL@AAO-4-ATP納米基底進(jìn)行表征。透射電子顯微鏡（TEM）表征證實(shí)了Au/Ag花狀納米結(jié)構(gòu)FL的形貌。觀測(cè)到的粒徑小于100 nm。能譜元素分析（EDS）表明Au/Ag FL中同時(shí)存在Ag和Au成分。選區(qū)電子衍射（SAED）結(jié)果證實(shí)了Au/Ag FL的多晶結(jié)構(gòu)。紫外-可見光譜在660 nm附近呈現(xiàn)明顯的吸收峰。Au/Ag FL負(fù)載于AAO薄膜上的形貌通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM）表征顯示為致密堆積表面。EDS元素組成分析證實(shí)了樣品中存在Ag和Au。EDS面掃描分析進(jìn)一步證實(shí)了Au/Ag FL在AAO基底上的均勻分布。通過(guò)SEM分析確定了Au/Ag FL的最佳負(fù)載量。結(jié)果表明，在80.0 μL負(fù)載體積下，AAO基底上呈現(xiàn)致密的Au/Ag FL分布（圖1A–D）。使用4-ATP作為信號(hào)探針測(cè)得的SERS信號(hào)強(qiáng)度也在此負(fù)載量下達(dá)到最高（圖1E–G）。

圖1 在AAO膜上Au/Ag FL的最佳體積（A-D）和相應(yīng)的SERS結(jié)果（E-G）。

經(jīng)4-ATP信號(hào)探針浸潤(rùn)后，Au/Ag FL@AAO的SEM形貌未發(fā)生變化（圖2A）。EDS元素分析表明，Au/Ag FL@AAO-4-ATP復(fù)合體系中存在Au、Ag、N和S元素，其中氮和硫元素來(lái)源于4-ATP（圖2B）。EDS面掃描圖像直觀地展示了N和S元素在基底表面的均勻分布（圖2C–G），這突顯了Au/Ag FL@AAO-4-ATP基底的強(qiáng)均質(zhì)性和穩(wěn)定性（圖2H）。既往研究表明了多種制備AAO負(fù)載型SERS基底的方法。例如，采用自組裝方法將銀納米粒子沉積于AAO膜的表面制備SERS基底。或者采用浸漬技術(shù)，將AAO膜浸入王水中直接在膜上生長(zhǎng)金納米粒子簇。相比之下，本研究采用真空輔助沉積技術(shù)制備SERS基底。該方法的若干優(yōu)勢(shì)在于：首先，真空輔助技術(shù)確保納米花朵的均勻沉積，避免了"滴干"法或浸漬法中常見的團(tuán)聚問(wèn)題。其次，Au/Ag納米花朵獨(dú)特的花狀形貌提供了比簡(jiǎn)單納米粒子或簇更大的活性表面積和更強(qiáng)的電磁場(chǎng)增強(qiáng)效果。第三，制備的Au/Ag FL納米基底具有高穩(wěn)定性和可重復(fù)性，這對(duì)于在牛奶等復(fù)雜樣品中進(jìn)行準(zhǔn)確SERS測(cè)量至關(guān)重要。

圖2 SEM(A), EDS (B), EDS mapping (C–G) and Raman mapping (H)Au/Ag FL@AAO-4-ATP納米基底的表征的結(jié)果。

接下來(lái)，驗(yàn)證波長(zhǎng)選擇性ICPA-PLS模型結(jié)果。ICPA方法進(jìn)一步應(yīng)用于闡明其適用范圍。本模型采用二進(jìn)制矩陣采樣（BMS）技術(shù)，隨機(jī)組合光譜的波長(zhǎng)子區(qū)間，以生成相應(yīng)的PLS校正模型。模型種群分析（MPA）用于評(píng)估這些模型，并采用指數(shù)衰減函數(shù)（EDF）消除對(duì)貢獻(xiàn)較小的子區(qū)間，以實(shí)現(xiàn)空間收縮。經(jīng)過(guò)多次迭代，確定了最佳波長(zhǎng)區(qū)間，以確定最小的RMSECV。ICPA方法用于篩選與Au/Ag FL@AAO-4-ATP SERS傳感結(jié)合PLS定量分析金黃色葡萄球菌濃度相關(guān)的顯著變量。對(duì)于全光譜，在1135-1165 cm^?1、1181-1248 cm^?1和1560-1587 cm^?1區(qū)間內(nèi)，從總共752個(gè)變量中篩選出108個(gè)變量（圖3A）。獲得的結(jié)果為Rc = 0.9693，RMSECV = 0.42，Rp = 0.9556和RMSEP = 0.51（圖3B）。對(duì)于特征光譜，BOSS-PLS模型在五個(gè)區(qū)間內(nèi)篩選出82個(gè)相關(guān)變量，分別為718–727、1203–1226、1301–1330、1350–1379和1555–1635，從總共312個(gè)變量中篩選出（圖3C）。模型結(jié)果為Rc = 0.9655，RMSECV = 0.445，Rp = 0.9626和RMSEP = 0.466（圖3D）。

圖3 (A) 應(yīng)基于完整光譜選擇的變量；(B) 基于完整光譜的ICPA-PLS模型的校準(zhǔn)集和預(yù)測(cè)集；(C) 基于特征光譜選擇的變量；(D) 基于特征光譜的ICPA-PLS模型的校準(zhǔn)集和預(yù)測(cè)集。

本研究基于完整且全面的譜變量，對(duì)三種定量模型進(jìn)行了比較評(píng)估，如表1所示。模型的預(yù)測(cè)性能通過(guò)Rc、RMSECV、Rp、RMSEP和RPD等評(píng)估指標(biāo)進(jìn)行衡量。ICPA-PLS模型在這些指標(biāo)上表現(xiàn)出更高的預(yù)測(cè)性能。該模型對(duì)完整譜和特征譜的定量分析分別獲得了RPD值3.3024和3.5583，證實(shí)了其預(yù)測(cè)能力。與其他模型相比，PLS模型的性能相對(duì)較低，這可能與建模數(shù)據(jù)中無(wú)關(guān)變量的高發(fā)生率以及依賴完整譜有關(guān)。相比之下，BOSS-PLS模型通過(guò)篩選特征變量提升了模型的預(yù)測(cè)能力。然而，BOSS方法忽略了連續(xù)變量之間的高相關(guān)性，可能導(dǎo)致在引導(dǎo)抽樣過(guò)程中遺漏特征細(xì)節(jié)。

綜上所述，本工作報(bào)道了一種創(chuàng)新的基于機(jī)器學(xué)習(xí)的波長(zhǎng)選擇自適應(yīng)SEA/SERS生物傳感器，用于檢測(cè)牛奶中金黃色葡萄球菌特異性基因。合成的Au/Ag FL@AAO/4-ATP基SERS納米底物被用作集成SEA檢測(cè)和波長(zhǎng)選擇機(jī)器學(xué)習(xí)工具的SERS基底。通過(guò)SEA檢測(cè)實(shí)現(xiàn)了金黃色葡萄球菌nuc T′基因的特異性擴(kuò)增。擴(kuò)增的DNA片段通過(guò)親核加成反應(yīng)與Au/Ag FL@AAO-4-ATP納米芯片捕獲。收集的SERS指紋信號(hào)使用三種不同的深度學(xué)習(xí)識(shí)別方法（PLS、BOSS-PLS和ICPA-PLS）進(jìn)行分析與比較。ICPA-PLS模型比其他模型表現(xiàn)出更優(yōu)越的預(yù)測(cè)性能；值得注意的是，使用特征譜圖的定量分析模型比全譜圖模型表現(xiàn)更好。所提出的方法驗(yàn)證結(jié)果在10至10⁶ cfu/mL范圍內(nèi)的預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)為0.948，低于P=0.05時(shí)的臨界t值。所提出的SERS/SEA/機(jī)器學(xué)習(xí)集成平臺(tái)研究為在真實(shí)樣品中快速簡(jiǎn)便地檢測(cè)金黃色葡萄球菌提供了一個(gè)新途徑，并展示了在簡(jiǎn)單條件下進(jìn)行的高靈活性檢測(cè)能力，與需要精確溫度控制和熱循環(huán)步驟的PCR相比。該研究為確保食品和環(huán)境安全而推進(jìn)SEA/SERS生物分析提供了新的視角。

論文來(lái)源：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117363

來(lái)源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~段子璇。